1941年1月4日，葉挺、項英率領新四軍軍部、一個教導團、一個特務團和第一支隊、第二支隊、第三支隊的各兩個團，共9000餘人，由涇縣的雲嶺(新四軍軍部所在地)起程，向茂林前進。茂林地區叢山環繞，斷崖絕壁，國民黨軍隊預先在這裏布置了由顧祝同、上官雲相指揮的七個師(約8萬餘人)。7日，新四軍到達茂林，國民黨軍立即對它實行包圍襲擊。新四軍指戰員倉卒應戰，並電國民黨當局質問。但蔣介石詭稱已電顧祝同查詢真相，實則密令各部切實執行其「一網打盡，生擒葉項」的毒計。新四軍指戰員在軍長葉挺的指揮下，奮不顧身，英勇地抗擊了國民黨反動部隊的圍攻。經七晝夜血戰，終以眾寡懸殊，彈盡糧絕，除傅秋濤等率領3000餘人突圍外，大部皆壯烈犧牲。軍長葉挺親赴敵108師師部談判，竟被扣押，副軍長項英、參謀長周子昆、政治部主任袁國平等皆遇難。
蔣介石隨即在1月17日以國民黨軍事委員會的名義，反咬一口，宣布新四軍「叛變」，取消其番號，將軍長葉挺「革職」，「交軍法審判」，並令湯恩伯、李品仙的20餘萬軍隊進攻江北新四軍。至此，國民黨發動掀起了第二次反共高潮。
蘇聯領導人斯大林對蔣介石這種消極抗日、積極反共的行徑瞠目結舌，對派駐中國的蘇軍顧問沒能了解、制止國民黨的這種剿共行為更是憤怒，他電令顧問團總顧問崔可夫查明此事。崔可夫少將（後為蘇聯元帥）1940年秋來到中國擔任蘇聯軍事使團團長（即蔣介石的總軍事顧問），斯大林給他布置的任務除了指導中國的抗日戰爭，還要求他協調國共兩黨的關系。此時，中共領導人毛澤東憤然致電質問崔可夫：「蔣介石無法無天至此，請問崔可夫如何處理？」重壓之下的崔可夫立刻聯系派駐顧祝同（皖南事變的肇事者，時任第三戰區司令）第三戰區的兩名蘇聯軍事顧問了解情況，沒料到這兩人比他還糊塗，竟問：「真的發生了皖南事變？」
皖南事變的根本原因在於，國民黨軍隊對新四軍的長期敵意防範和對蘇軍顧問的蒙蔽。以顧祝同為中心，上至蔣介石，下至各個師長、團長，都對以前的死對頭——共產黨軍隊懷恨在心。此前，在河北、晉西和蘇北等地，國民黨軍曾與中共軍隊發生沖突，但是都以國民黨軍慘敗告終。所以，國民黨部分軍事領導人心理上極不平衡，必欲重兵報復。在這種情況下，顧祝同等人想從軍事上一勞永逸地剿滅共產黨的願望自然更加強烈。國民黨為此決心不惜武力驅除、消滅皖南要害地區的新四軍。恰逢新四軍領導人項英、葉挺在撤退到長江以北的問題上猶猶豫豫，這在顧祝同等人看來，更是個好機會。
在第三戰區總部的國民黨軍內部這樣說：「蘇聯顧問是共產主義國家派在國軍中的探子，若讓他知道國軍打共產黨新四軍，於我們很不利。」兩個顧問也很想多了解些情況，但人生地不熟，語言也不通，加上和當地共產黨沒有直接聯繫，所以對國共兩黨的鬥爭情況一點也不清楚。另外，蘇聯軍事顧問團的一項規定也束縛了他們的手腳，按照他們和國民黨政府的約定，蘇聯軍事顧問不能直接聯絡中國共產黨人，在八路軍所在的第二戰區（由閻錫山、朱德領導）就因有八路軍而未設蘇聯顧問。
當時屯溪地區的中共組織已對皖南國民黨軍隊頻繁調動有所警覺，懷疑顧祝同要出兵襲擊堅持抗戰的新四軍，為此曾先後密派兩名情報員去涇縣茂林（今安徽省涇縣茂林鎮）向新四軍軍部通風報信，但在半途即被軍統特工逮捕，慘遭活埋。情況如此迫切，被蒙在鼓裏的兩個蘇軍顧問還電告重慶的蘇軍顧問團「情況正常」，甚至直到「皖南事變」發生後十餘天，這兩人居然還依舊電告「正常」。
當時的國際輿論也對共產黨新四軍有利，在重慶的外國記者對皖南事變很不滿，英國援華總會致電蔣介石，要求給新四軍以正當待遇，來華考察的美國總統特使居里甚至告訴蔣介石，如果再打共產黨軍隊，美國就會叫停援助。蔣介石試圖盡快息事寧人，虛與委蛇地表示只針對新四軍，不涉及共產黨或八路軍。
事變發生後，中共採取了堅決的鬥爭政策策略。不僅嚴厲譴責國民黨頑固派的罪惡陰謀，而且嚴正地宣布重建新四軍。1月20日，毛澤東發布中共中央革命軍事委員會命令，任命陳毅為新四軍代理軍長，劉少奇為政治委員，張雲逸為副軍長，賴傳珠為參謀長，鄧子恢為政治部主任。1月22日，毛澤東以中共中央軍委發言人的名義發表談話，聲討國民黨製造「皖南事變」的滔天罪行，揭露國民黨和親日派的內戰陰謀。向國民黨提出懸崖勒馬，停止挑釁，懲辦皖南事變禍首，恢復葉挺自由，交還新四軍全部人槍，逮捕親日派首領等解決時局的十二條辦法。周恩來在重慶，代表中共中央向國民黨當局提出嚴重抗議，並在《新華日報》上發表了為皖南死難者致哀的悼詞：「千古奇冤，江南一葉；同室操戈，相煎何急！」揭露國民黨頑固派的陰謀。（百年偉業系列之二十二）
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